硝酸纖維素膜注意事項:
1) 由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進(jìn)行分析。
2) 對于貼壁細(xì)胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3) 實驗中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中EGFP會變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因為固定過程中細(xì)胞通透性增加會產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對結(jié)果產(chǎn)生干擾。
4) 如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
5) 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

6) Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

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